非天然氨基酸（Unnatural Amino Acids, UAAs）技術(shù)通過(guò)擴(kuò)展遺傳密碼，使研究者能夠在蛋白質(zhì)中引入自然界不存在的化學(xué)基團(tuán)，為蛋白標(biāo)記、結(jié)構(gòu)解析、反應(yīng)活性調(diào)控及新材料構(gòu)建提供未有的可能性^[1]。隨著 UAAs 工具箱的不斷豐富，該策略正在成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白工程與生物藥開(kāi)發(fā)中的關(guān)鍵技術(shù)手段。

近年來(lái)，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）體系的快速發(fā)展，使 UAAs 的位點(diǎn)特異性插入效率、可控性與通量能力得到顯著提升，為膜蛋白、酶類(lèi)蛋白及復(fù)雜復(fù)合蛋白的功能化研究打開(kāi)了全新空間。

盡管細(xì)胞體系是生物學(xué)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)，但在 UAAs 插入方面卻存在天然瓶頸：

1. 插入效率低且缺乏穩(wěn)定性，部分 UAAs 在細(xì)胞內(nèi)根本無(wú)法使用

2. 宿主細(xì)胞代謝對(duì)實(shí)驗(yàn)條件具有嚴(yán)格限制

3. 對(duì)膜蛋白、毒性蛋白等難表達(dá)蛋白幾乎不可行

膜蛋白折疊復(fù)雜、要求特定微環(huán)境，而插入 UAAs 會(huì)進(jìn)一步增加錯(cuò)誤折疊與失活的風(fēng)險(xiǎn)；毒性蛋白則直接威脅宿主細(xì)胞的生存，使細(xì)胞體系難以維持表達(dá)流程。

綜上，細(xì)胞體系在 UAAs 插入方面難以實(shí)現(xiàn)可控、可重復(fù)、可擴(kuò)展的實(shí)驗(yàn)需求。

1. 開(kāi)放體系，可精確調(diào)控，實(shí)現(xiàn)更高插入效率

CFPS 反應(yīng)體系不受細(xì)胞膜與代謝網(wǎng)絡(luò)限制，實(shí)驗(yàn)者可以直接調(diào)控：

圖1：無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系示意圖

2. 對(duì)蛋白毒性不敏感，天然適用于膜蛋白與難表達(dá)蛋白

CFPS 無(wú)需維持細(xì)胞生命活動(dòng)，因此：

這使 CFPS 成為膜蛋白 UAAs 修飾、難表達(dá)蛋白合成的重要平臺(tái)。

3. 易于構(gòu)建高通量體系，適合蛋白工程與藥物篩選

CFPS 可在 96/384 孔板上實(shí)現(xiàn)數(shù)十至數(shù)百反應(yīng)的并行開(kāi)展，使以下任務(wù)在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成：

高通量 UAAs 操作讓CFPS 成為新材料開(kāi)發(fā)、先導(dǎo)化合物篩選和定向進(jìn)化中的關(guān)鍵加速工具。

圖2：珀羅汀非天然氨基酸插入案例

CFPS 技術(shù)正在從根本上改變 UAAs 插入和蛋白功能化研究的實(shí)驗(yàn)范式。憑借其開(kāi)放、高效、可控性強(qiáng)以及對(duì)膜蛋白友好的特性，無(wú)細(xì)胞體系已成為 UAAs 插入的理想平臺(tái)，特別適合：

[1] Liu CC, Schultz PG. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 2010;79:413-444..

[2] Silverman AD, Karim AS, Jewett MC. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 2020;21(3):151-170.

[3] Martin RW, Des Soye BJ, Kwon YC, et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nat Commun. 2018;9(1):1203.

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